La confirmation du diagnostic

Suite à ces examens simples de dépistage des individus drépanocytaires, le diagnostic de certitude de l’anémie SS peut être posé par trois techniques possibles :

 

    • Les électrophorèses de l’hémoglobine, à confirmer par des tests simples de falciformation ou de solubilité,

 

    • L’isoélectrofocalisation,

 

  • La chromatographie liquide haute pression.

Les Electrophorèses de l’hémoglobine
Chez les individus homozygotes, l’hémoglobine A1 a totalement disparu, remplacée par l’hémoglobine S. La mutation 6 : GLU VAL modifie le point isoélectrique de la chaîne et donc celui de l’hémoglobine S, tétramère 22.

 

    • Electrophorèse à pH alcalin sur support d’acétate de cellulose : l’HbS est caractérisée par une mobilité plus lente que l’HbA. Cependant, environ 250 mutations ponctuelles de l’hémoglobine peuvent engendrer un changement de charge analogue et donc une migration identique à celle de l’HbS. Il faut donc au moins un autre critère pour pouvoir affirmer la présence d’HbS.

 

  • Electrophorèse en citrate agar à pH acide : elle différencie les hémoglobines C, E, O, Arab et les hémoglobines D, G et S qui ont la même migration sur acétate de cellulose à pH alcalin.

Les différentes hémoglobines sont quantifiables par densitométrie optique du tracé électrophorétique, mais cette méthode est trop imprécise pour évaluer les faibles concentrations des fractions F et A2.
Chez un individu drépanocytaire homozygote, l’électrophorèse révèle trois bandes de migration :

 

    • l’HbS, 75 à 95 %. Elle remplace l’HbA1,

 

    • l’HbA2, 2 à 4%,

 

  • l’HbF, 1 à 15%. Son taux est très variable d’un individu à l’autre et a une valeur pronostique : les individus ayant un taux élevé d’HbF sont moins symptomatiques car seules les hématies sans HbF se falciforment.

 

Par électrophorèse, le diagnostic de drépanocytose est porté vers l’âge de 6 mois à 1 an, lorsque l’HbF laisse place à l’HbS.

Le test d’EMMEL (test de falciformation)
Il s’agit d’un test simple consistant à provoquer in vitro la desoxygénation puis la polymérisation de l’hémoglobine. Après incubation d’une goutte de sang avec une substance réductrice comme le métabisulfite de sodium, on observe au microscope la falciformation des hématies.

 

En pratique, le test de falciformation peut être couplé à une électrophorèse de l’hémoglobine à pH alcalin, pour pouvoir affirmer qu’une bande suspecte ayant migré sur acétate de cellulose correspond à de l’hémoglobine S.

 

Le test de falciformation ne peut être utilisé isolément pour diagnostiquer l’anémie SS, par manque de sensibilité et de spécificité : de nombreux faux positifs et faux négatifs sont observés et la distinction entre forme hétérozygote et forme homozygote ne peut être faite de façon fiable.

Le test d’ITANO (test de solubilité)
Ce test met en évidence in vitro la polymérisation de l’hémoglobine S et son caractère insoluble. Il consiste à désoxygéner une solution diluée d’hémoglobine, dont l’activité est fortement accrue par l’utilisation d’un tampon phosphate de force ionique élevée. En présence d’HbS et à température ambiante, un trouble apparaît : la centrifugation montre qu’il s’agit d’un précipité d’hémoglobine.

 

Le test de solubilité peut également servir de test de confirmation à une électrophorèse de l’hémoglobine à pH alcalin révélant une bande de migration suspecte.

L’IsoElectroFocalisation (IEF)
Cette technique de migration en deux dimensions est plus résolutive que l’électrophorèse en pH alcalin : elle permet de distinguer les HbD et G de l’HbS. De même, l’IEF est une technique très sensible, révélant la présence de faibles taux d’HbS. C’est la méthode de référence pour le diagnostic néonatal des hémoglobinopathies.

 

Le prélèvement consiste en une simple goutte de sang perlée au talon et absorbée sur papier buvard.

 

Comparée à une électrophorèse simple, l’IEF permet la réalisation d’un plus grand nombre de tests en une seule série, ce qui est intéressant pour les dépistages massifs de la drépanocytose au sein d’une population.

La Chromatographie Liquide Haute Pression (CLHP)
Très sensible et très spécifique, cette technique permet la séparation d’un très grand nombre d’hémoglobines, par échange sur des résines cationiques.

 

De plus, les différentes fractions HbA, HbA2, HbF et HbS, présentes même à de faibles taux, peuvent être quantifiées.